如何让分离单糖和多糖

如何让分离单糖和多糖
如何让分离单糖和多糖

如何让分离单糖和多糖
1．多糖的分离
1．1分级沉淀法
糖类多数可溶于水,三糖以下尚可溶于乙醇.随着聚合度的增大,在乙醇中的溶解度逐步降低.根据这一性质,在糖的浓水溶液中,分次加入乙醇,使酵的浓度渐增,5％.10％,15％,20％…90％,分取各次析出的沉淀,在产量和醇浓度之间画出曲线,以此可以粗略地观察出糖的组分.若遇糖的衍生物,如甲醚、乙酸醑,其极性低于糖,可在有机溶剂中进行分级沉淀嘲1.多糖的分子量范围广,且有共沉淀现象.此法只能作粗略的分离用,需反复进行及综合使用别的方法才能达到糖的组分均一,物理常数恒定.
1.2凝胶层析法
凝胶层析法(凝胶过滤法或分子筛层析法)主要利用具有三维网状结构的多孔性凝胶,其孔径大小决定于合成凝胶时所加交联剂的程度.当含有混合溶质的溶液流经适当的凝胶柱时,小分子易扩散入孔中,而大的则不易扩散,各溶质洗脱顺序随分子量由大及小,渐次流出.此法对于不同聚合度的糖类分离特别有效.方法快速、简单,条件温和.常用的有葡聚糖凝胶(sephadex G)、琼脂糖凝胶(SepharoseBio—gel A)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio—gel P)等,常用的洗脱剂是各种浓度的盐溶液及缓冲液,但它们的离子强度最好不低于0．020.
1．3纤维素柱层析
纤维素对多糖的分离,是利用混合糖的溶液,流经预先以另一种溶剂(如乙醇)混悬的纤维素柱,多糖在此多孔支持介质上析出沉淀,再以递减醇浓度的稀醇逐步洗脱,溶出各种多糖.流出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出柱,水溶性差的最后出柱,与分级沉淀法正好相反.此法较分级沉淀法为优,因为其接触面大.纤维素柱层析还可用丙酮、水饱和丁醇、异丙醇、水饱和甲乙酮等,或用丁醇：乙酸：水(9：2：1)、乙酸乙酯：乙酸：水(7：2：2)等系统.混合溶液可调节其组成比例.酸性多糖层析时,可利用其和季铵盐络合沉淀的反应,在洗脱液中加少量十六烷基吡啶氯化物,可使分离软骨硫酸盐等多糖获得好效果.
1．4离子交换纤维素层析
常用的阳离子交换纤维素有CM-cellulose、P—celhlose、SE—cellulose、SM-cellulose；阴离子交换纤维素有DEAE-cellulose、ECTE—cellulose、PAB-cellulose、TEAE-cellulose等.其中阳离子交换纤维素特别适用于分离酸性、中性多糖和粘多糖.交换剂对多糖的吸附力与多糖的结构有关,通常多糖分子中酸性基团增加则吸附力随之增加：对于线状分子,分子量大的较分子量小的易吸附；直链的较分枝的易吸附.在pH 6时酸性多糖可吸附于交换剂上,中性多糖则不能被吸附.当用硼砂将交换荆预处理后,则中性多糖也可以被吸附.分离酸性多糖所用的洗脱剂通常是pH相同离子强度不同的缓冲液,分离中性多糖的洗脱剂则是不同
浓度的硼砂溶液.
1.5季铵盐沉淀法
阳离子型清洁剂如十六烷基三甲铵盐(CTA盐)和十六烷基吡啶盐(CP盐)等和酸性多糖阴离子可以形成不溶于水的沉淀,使酸性多糖自水溶液中沉淀出来,中性多糖留存在母液中而分离.若再利用硼酸络合物.中性多糖亦可沉淀,或在高pH的条件下,增加中性醇羟基的解离度而使之沉淀.
1．6制各性区域电泳
分子大小、形状及所负电荷不同的多糖其在电场的作用下迁移速率是不同的,故可用电泳的方法将不同的多糖分开,电泳常用的载体是玻璃粉.具体的操作是用水将玻璃粉拌成胶状、装柱,用电泳缓冲液(如0．05mol／L硼砂水溶液,pH9．3)平衡3天,将多糖加于柱上端,接通电源,上端为正极(多糖的电泳方向是向负极的),下端为负极,其单位厘米的电压为1．2-2V,电流30—35mA,电泳的时间为5 －12小时.电泳完毕后将玻璃粉载体推出柱外,分割后分别洗脱、检测.该方法分离效果较好,但只适合于实验室小规模使用,且电泳柱中必须有冷却夹层.
1．7金属离子沉淀法
铜盐沉淀多糖,可用CuCl2,CuSO4,Cu(OAc)：的溶液或是Fehling试剂、乙二胺铜试剂.通常需加过量的试剂用于沉淀,但Fehling试剂不可太多过量,因其有使多糖铜复合物沉淀重新溶解的危险.沉淀分解恢复可用酸的醇溶液或用螯合试剂.常用的铜盐分级沉淀法是Fehling试剂法和醋酸铜乙醇法.饱和Ba(OH)：溶液可使树胶类多糖沉淀,特别容易使B(1,4)一D一甘露聚糖沉淀而和木聚糖分离.另据报道,国外多采用LKB柱色谱,用比旋光度、示差折射及紫外检测多糖,各组分的峰位自动记录,分离效果高且方便.